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摘要:生物超弱发光是生物系统在生命活动中的微弱发光现象。为了准确测量生物超弱发光,设计了一种用于生物超微弱发光的专用采集系统。系统的激发光源由单只大功率LED及光学系统构成,用压控恒流源调整LED光照强度,通过电子快门精确控制光探测器的采集时间。测量金心吊兰叶片的延迟发光结果表明,该系统测量精度高、重复性好。
关键词:生物超弱发光;检测;电子快门;压控恒流源

O 引言


生物超弱发光是生物在生命活动过程中,辐射出的一种极其微弱的光子流,分为自发发光和延迟发光。现在已经证明,它与生理代谢、光合作用和细胞分裂等等许多生命过程有关,并且对环境极为敏感。由于生物超弱发光蕴涵着丰富的生命信息,对其探测、分析与解读是近十几年来许多领域共同关心的课题。目前,已有不少研究,展示出其在揭示生命运转机理以及农业、环境保护、医疗、食品卫生等许多领域的应用潜力。由于生物超弱发光的强度较弱,且延迟发光衰减很快,其采集涉及到外来激发光的精确控制和微弱自体发光的实时测量,至今未见成熟的专用仪器,给研究带来困难。鉴于此,本文开发了一类利用LED激发的生物超弱发光采集系统,将LED激发光源、电子快门和光探测器整合在一起,通过单片机精确控制激发光源的光照时间与电子快门的开启时间,使超弱发光尤其是延迟发光重复性测量的精度大大提高。

1 系统总体设计
该系统测量生物超弱发光的时域信息,采用单光子计数探测系统。主要包括激发光源、光源驱动电路、快门控制模块、光探测器、数据采集与处理模块、温度控制模块、暗室和计算机。系统总体结构如图1所示。

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样品放在暗室中测量,隔绝外界光线影响。单只大功率超高亮度LED发出的光经过透镜变换为平行光后,均匀照射到样品上,中控模块的单片机精确控制光强和辐照时间,温度控制器保持样品处于恒温状态,快门驱动模块按照预设程序控制电子快门的开闭,PMT进行生物发光的采集。

2 系统硬件设计
2.1 主控制电路
主控电路负责整个系统的正常运行,进行光照时间、光照强度和快门开闭的控制,结构框图如图2所示。主要包括微处理器、压控电流源、光照时间控制、快门开关控制、LCD显示、键盘接口和温度控制模块。

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2.2 激发光源及其驱动电路
生物体的自发发光强度较稳定,而延迟发光随时间衰减很快,若将样品用激发光源在暗室外照射后再拿进暗室测量,光照结束时间和测量开始时间的间隔很难控制,对实验人员的技能要求较高。如果采用光源内置的方法,就能很好地解决这个问题。
系统采用单只大功率发光二极管(LED)作为激发光源,通过透镜变换为平行光,保证样品受光面的光强均匀分布。激发光源采用蓝色LED,中心波长为467nm,带宽为20nm,可以满足一般实验要求。也可以根据实验的要求,将蓝色LED更换为红色、绿色和紫色等颜色的LED。
对LED光强的控制通过改变注入LED的电流大小来实现。为了保证实验的精度,要保证LED驱动电流的恒流性,还要使得电路的电流大小可调,实现光源亮度的调节。因此,系统选用精密数控大功率电流源电路作为LED的驱动电路。电路的原理图如图3所示。

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驱动电路主要由微处理器、液晶显示与键盘输入、数/模转换与模/数转换、压控恒流源、差动放大电路等子模块组成。


2.2.1 压控恒流源
压控恒流源是LED驱动电路的重要组成部分,它的功能是通过调节控制电压来达到对电流的控制,它的性能决定了LED亮度的稳定程度。压控恒流源的电路如图4所示,U1B和R8,R9构成电压跟随器,运放的高输入阻抗,近似可以认为U1B没有分流作用,则流经V2的电流全部流入负载RL,并且有V3=V2。U1C和电阻R10,R11,R12构成反相器,有V4=-V3=-V2。U1A和电阻R1,R2,R3,R13构成反向加法器电路,输入信号分别为Vi和V4,输出电压V1=-(Vi+V4),又因为V4=-V2,所以输出电压V1=-(Vi-V2)。运放UB1并无分流作用,因此电阻Rm两端的电压为Vm=V1-V2=-Vi,流经Rm和负载RL的电流相等,都为I=Vm/Rm=-Vi/Rm。可以看出,负载上的电流由输入电压Vi和电阻Rm共同决定,只要这两个量不变,电流就会保持恒定。通过改变数模转换器的输出电压,即可调节负载RL上的电流。

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负载RL是大功率的LED,所需要的驱动电流一般在0~300 mA,为了保证恒流电路的功率输出,加入了电流扩展电路。该扩展电路采用简单常用的图腾柱式电流扩展方法。功率三极管使用大功率的2N1346,同时连接散热片并加装散热风扇,以保证电路稳定工作。
2.2.2 差动放大电路
输出电流经采样电阻Rm采样,接入差动放大电路的输入端。在电流源电路中,采样电阻的精确程度和温度稳定性直接关系到电流输出的稳定性。因此系统中采样电阻使用精密金属膜电阻,该电阻温漂小于5x10-5℃-1,阻值为2 Ω,额定功率为10 W。
差动放大电路使用较常用的仪用放大器,电路原理如图5所示。

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仪用放大电路具有较高的输入阻抗,能够避免采样电路对电流源的影响;同时又具有较大的共模抑制比,保证采样的准确性,避免干扰。由于采样电阻Rm上流经的电流变化范围是0~300 mA,范围较大,所以将差动放大电路的放大倍数设置为1。
2.2.3 数/模和模/数转换
数/模转换采用C8051F021单片机内部集成的DAC1,DAC的输出在每次中断时根据A/D的采样值计算后进行更新。
模/数转换采用单片机内部集成的12位逐次逼近寄存器型ADC。A/D和D/A的电压基准VREF由片外的LM336基准稳压源提供。
2.3 快门控制
为了防止LED光强对PMT造成损伤,在样品室与PMT之间加装了电子快门来保护PMT。开启LED时,快门关闭;激发光源照射样品结束时,LED熄灭,快门打开,PMT开始采集样品的发光。由于延迟发光快速衰减,为了保证能够及时采集延迟发光,该系统采用的电子快门的响应时间为1μs,快门驱动电压为(12±O.1)V,电路接通则快门开启,断开则快门自动关闭,控制简单。但电子快门对电压稳定度要求较高,需要采用单独的稳压电源供电,否则有可能因电压波动造成快门意外关闭。


电子快门驱动电路如图6所示,开关管连接单片机P2.7口,由单片机控制快门的开启和关闭。当单片机P2.7口输出为“0”时,快门关闭;当单片机P2.7口输出为“1”时,快门打开。用示波器测量驱动电路的延迟时间在1μs以内,考虑到快门的延迟也在1μs,可以认为快门总体的延迟对测量的影响可以忽略。

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3 系统软件设计
系统软件部分采用模块化设计方法,将整个程序划分为若干模块,通过主程序对各个子模块的调用,将模块连接成一个完整的程序。
根据系统控制功能的要求,确定了系统软件的主要功能有:系统初始化,寄存器设定,键盘设定初始值(光照时间,快门开启时间,流过LED的电流值大小),液晶显示控制,电子快门控制。根据软件的功能要求,图7给出程序总体流程结构图,图8表示各模块之间的逻辑关系。

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4 仪器测试
系统硬件连接完成,软件调试通过后。接着对仪器进行了测试。
4.1 光源测试
使LED驱动电路的电流在O~300 mA范围变化,测试LED的发光强度。测出驱动电流与光强的关系如图9所示。

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5 结语
本文设计了用于测量生物超弱发光的专用测量系统,系统的激发光源由单颗高亮度大功率LED及光学系统构成,用压恒流源调整LED光照强度,通过电子快门精确控制光探测器的采集时间,暗室的背景噪声在50 c/s之下。应用本系统测量金心吊兰叶片的延迟发光的结果表明,该系统测量精度高、重复性好,得到了较理想的测量结果。

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